Elizabeth Holmes sinh vào tháng 2 năm 1984 tại Washington, D.C.. Cha cô, Christian Holmes IV, đã làm việc ở Hoa Kỳ, Phi Châu và Trung Quốc cho các cơ quan chính phủ như USAID. Mẹ cô, Noel Anne (Daoust),[9] là nhân viên của quốc hội. Cô có một người anh em, Christian Holmes V, làm giám đốc quản lý sản phẩm tại Theranos. Một trong những tổ tiên của cô cũng là đồng sáng lập viên của công ty Fleischmann's Yeast.[10]

Holmes nhập học ở trường ST. John's tại Houston. Trong lúc học tại trường này, cô có niềm yêu thích với việc lập trình máy tính và nó đã giúp cô bắt đầu việc kinh doanh đầu tiên của mình là bán các bản lập trình C++ cho các trường đại học ở Trung Quốc.